O Museu Nossa Senhora Aparecida foi fundado por iniciativa de Conceição Borges Ribeiro Camargo, professora, escritora e pesquisadora aparecidense. A inauguração se deu em 8 de setembro de 1956, com a bênção do Cardeal Dom Carlos Carmelo de Vasconcellos Motta, primeiro Arcebispo de Aparecida.

A formação de acervos e coleções teve início com o interesse da Prof.ª Conceição pela preservação dos achados arqueológicos encontrados na cidade, somando-se a eles objetos de valor histórico e artístico coletados entre as famílias da região e doados pelos devotos.

O primeiro local de funcionamento foi o prédio das Oficinas Gráficas de Arte Sacra de Aparecida, no Convento das Irmãs de São Pedro Canísio. Mais tarde, o Museu foi transferido para a Galeria do Hotel Recreio, onde permaneceu até a mudança definitiva para a Torre do Santuário, em 12 de outubro de 1967, passando a ocupar o 2º andar.

A partir de 2003, iniciou-se um significativo processo de reestruturação do Museu, com o objetivo de organizar as ações relacionadas à gestão do acervo museológico e do espaço museográfico, assim como a instalação de Reserva Técnica e Laboratório de Restauro.

Atualmente, o Museu conta com exposições de longa duração e temporárias sobre diversas temáticas, tendo como pano de fundo a história da devoção à Padroeira do Brasil.